Polarisierte Durchlichtmikroskopie, Phasenkontrast und DIC mit dem PureFocus850

24.01.24

Wie passt sich der Hardware-Autofokus an spezielle Mikroskopietechniken in den Biowissenschaften an?

In unserem letzten Artikel haben wir die gängigsten Mikroskopie Techniken in der Biowissenschaft besprochen und wie der Prior Hardware-Autofokus, der PureFocus850, mit diesen Techniken verwendet werden kann und welche Vorteile er bietet. Dieses Mal untersuchen wir speziellere Techniken, die mehr optische Elemente in den Lichtweg einbringen. Auch wenn dies für ein optisches Gerät wie einen Hardware-Autofokus eine Herausforderung zu sein scheint, erklären wir, wie der PureFocus850 mit Blick auf diese Techniken entwickelt wurde und wie negative Wechselwirkungen mit diesen optischen Elementen vermieden werden können.

Mikroskopie mit polarisiertem Licht

Die Mikroskopie mit polarisiertem Licht ist eine spezielle Technik, die für bestimmte biowissenschaftliche Proben verwendet wird. Sie stützt sich auf einen Polarisator, der weißes Licht, das durch die Probe fällt, in eine bestimmte Richtung linear polarisiert, und einen Analysator (ebenfalls ein linearer Polarisator), der das Licht auswählt, dessen Polarisationswinkel durch die Probe verändert wurde. Licht, das nicht durch die Probe verändert wurde, oder Licht aus der Umgebung des Mikroskops wird durch den Analysator blockiert. Normalerweise sind Polarisator und Analysator orthogonal zueinander ausgerichtet, um eine maximale Auslöschung von unverändertem Licht zu erreichen. Licht kann auf verschiedene Weise polarisiert werden – zum Beispiel zirkular -, aber für die Zwecke dieses Artikels werden wir nur die lineare Polarisation.

Was ist lineare Polarisation?

Licht kann als eine Welle betrachtet werden. Die Polarisation bezieht sich auf die Richtung der Schwingung senkrecht zur Bewegungsrichtung der Welle. Weißes Licht ist unpolarisiert – die Lichtwellen schwingen in alle Richtungen. Ein Polarisator lässt nur Licht passieren, das in einer bestimmten Richtung schwingt. Im Zusammenhang mit einem Polarisationsmikroskop wird die Probe also nur von Licht mit einer bestimmten Polarisation beleuchtet.

Proben, die mit Polarisationsmikroskopie verwendet werden, weisen Doppelbrechung auf – linear polarisiertes Licht, das durch die Probe fällt, wird “doppelt gebrochen” und erzeugt zwei Lichtstrahlen, die um 90° zueinander polarisiert sind. Die Komponenten dieser Strahlen interferieren dann beim Durchgang durch das Analysegerät miteinander, wodurch der Kontrast bestimmter Bereiche der Probe verstärkt wird und sie je nach ihren Eigenschaften eine Farbe annehmen. Picrosiriusrot ist ein Farbstoff, der in der Pathologie zum Nachweis von Fibrose verwendet wird und Kollagen unter polarisiertem Licht rot erscheinen lässt. Die Polarisation kann auch bei der Darstellung von ungefärbten Proben nützlich sein, z. B. bei der Identifizierung von Gichtkristallen oder bei der Analyse von petrologischen Proben.

Ist es möglich, Hardware-Autofokus in der Polarisationslichtmikroskopie zu verwenden?

Ja – vorausgesetzt, das Autofokussystem ist so eingestellt, dass Störungen durch den Analysator des Mikroskops vermieden werden. Der Analysator kann ein Problem darstellen, da Hardware-Autofokussysteme eine Laserquelle verwenden, die polarisiertes Licht aussendet, um den Fokus zu erfassen. Viele Autofokussysteme werden am Kameraanschluss des Mikroskops montiert, wo die Autofokus-Laserquelle durch den Polarisator des Mikroskops blockiert werden kann.

Das PureFocus850 wird jedoch im Unendlichkeitsbereich eines Mikroskops montiert, dadurch wird er mit der Polarisationsmikroskopie kompatibel. Bei der Mikroskopie mit polarisiertem Licht sollte es zwischen dem Objektiv und dem Analysator positioniert werden, um Interferenzen zu vermeiden. Bei den meisten handelsüblichen Mikroskopen kann der Analysator zwischen dem PureFocus850 und der Mikroskopkamera oder den Okularen angebracht werden.

Phasen-, Relief- und Gradientenkontrast

Biowissenschaftliche Proben sind in der Regel transparent. In der Vergangenheit wurden Färbungen verwendet, um den Kontrast zwischen verschiedenen Probenmerkmalen und dem Hintergrund zu verstärken. Das Hinzufügen von Färbemitteln ist zeitaufwändig, verschlechtert die Probe und verhindert die Bildgebung von lebenden Proben. Im Laufe der Zeit haben sich alternative Kontrastverfahren entwickelt, wie Phasenkontrast, Reliefkontrast (Hoffman-Modulation) und Gradienten-Kontrast.

Diese Techniken verwenden zwar unterschiedliche Komponenten, beruhen aber auf demselben Prinzip der Umwandlung von Phasenunterschieden des durch die Probe fallenden Lichts in Differenzen der Lichtintensität, wodurch der vom Mikroskopiker beobachtete Kontrast verstärkt wird. Der Phasenkontrast beruht auf der Phasenverschiebung, die beim Durchgang des Lichts durch die Probe entsteht, und auf der Interferenz zwischen dem verschobenen und dem nicht verschobenen Licht bei der Bildentstehung. Relief- und Gradientenkontrast beruhen auf Phasengradienten, die durch Unterschiede in der Probendicke in bestimmten Bereichen der Probe verursacht werden und dazu führen, dass das Licht in verschiedene Bereiche einer optischen Komponente mit variablen Übertragungseigenschaften abgelenkt wird. Beide Verfahren haben die Fähigkeit, Bereiche im Bild hervorzuheben, in denen Phasenunterschiede aufgetreten sind, im Gegensatz zum “Hintergrund”, in dem kein Phasenunterschied durch die Probe induziert wurde.

Was ist eine Phasendifferenz?

Einfach ausgedrückt, entsteht eine Phasendifferenz, wenn Licht von einem Medium (oder Brechungsindex) in ein anderes übergeht. Betrachtet man Licht als eine Welle, so ändert eine Änderung des Mediums, das das Licht durchläuft, den Punkt im Wellenzyklus des Lichts. Zellmerkmale wie Membranen und andere Organellen können als unterschiedliche Medien klassifiziert werden. Da das Licht, das diese Schichten durchläuft, die Phase ändert, können die optischen Elemente, die in jeder Technik verwendet werden, nun auf dieses Licht einwirken, um einen Kontrast (Unterschiede in der Signalamplitude) zu erzeugen, der vom Mikroskopiker gesehen werden kann.

Keine der für diese Techniken spezifischen Komponenten beeinträchtigt die Funktionalität des PureFocus850, da sein Laserlicht nicht mit ihnen interagiert. Trotz des verbesserten Kontrasts, der den kamerabasierten Autofokus praktikabler macht, ist die Geschwindigkeit eines hardwarebasierten Autofokus ein Vorteil für Anwendungen mit hohem Durchsatz. Da Phasentechniken in der Regel mit der Bildgebung von lebenden Zellen in Verbindung gebracht werden und jetzt zusammen mit künstlicher Intelligenz zur Charakterisierung von Organellen und anderen intrazellulären Merkmalen ohne Fluoreszenzmarkierung oder -färbung eingesetzt werden, kann der PureFocus850 auch Zeitrafferexperimente oder High-Content-Screening-Anwendungen unterstützen, bei denen ein Verlust des Fokus zu stundenlangem Zeitverlust führen kann.

Differentieller Interferenzkontrast

Der differentielle Interferenzkontrast (DIC) nutzt Aspekte der Phasenmikroskopie und der Mikroskopie mit polarisiertem Licht, um einen Kontrast in ansonsten transparenten oder schwach kontrastierten Proben zu erzeugen. Diese Technik zeichnet sich durch einen komplexen optischen Pfad aus:

1. Das von der Mikroskop-Beleuchtung ausgestrahlte Licht ist auf 45° polarisiert.
2. Das polarisierte Licht tritt in ein Nomarski-Wollaston-Prisma ein und wird in zwei um 90° zueinander polarisierte Strahlen getrennt.
3. Die beiden Strahlen durchdringen die Probe, werden aber geschert – sie durchdringen leicht unterschiedliche Punkte in der Probe.
4. Dies führt zu einer Phasendifferenz zwischen den beiden Strahlen, wenn sich die Probe im Brechungsindex oder in der Dicke unterscheidet. Die Größe der Phasendifferenz hängt von der Höhe des Brechungsindex- oder Dickenunterschieds ab.
5. Nach dem Durchgang durch die Probe werden die Strahlen durch ein zweites Nomarski-Wollaston-Prisma zu einem einzigen Strahl rekombiniert – die durch das erste Prisma verursachte Scherung wird durch das zweite Prisma aufgehoben. Die rekombinierten Strahlen sind immer noch in unterschiedlichen Richtungen polarisiert und interferieren daher nicht.
6. Der rekombinierte Strahl durchläuft einen Analysator, der die Polarisation der beiden Strahlen in dieselbe Ebene bringt, so dass sie interferieren können. In Bereichen, in denen durch die Probe eine Phasendifferenz erzeugt wurde, interferieren die Strahlen konstruktiv oder destruktiv. Wo keine Phasendifferenz induziert wurde, tritt keine Interferenz auf. Diese unterschiedliche Interferenz im Bild erzeugt einen 3D-ähnlichen Effekt, der verschiedene Merkmale hervorhebt.

Diese Interferenz erzeugt einen Effekt, der den Techniken der Phasenmikroskopie nicht unähnlich ist, vermeidet aber die hellen Halo-Artefakte, die typischerweise mit dem Phasenkontrast verbunden sind. Außerdem bietet sie eine höhere axiale (Z-Achse) Auflösung als die anderen Techniken.

Mit dem PureFocus850 können Mikroskopiker die Vorteile der hohen axialen Auflösung von DIC nutzen, indem sie beim Scannen über große Flächen oder Multiwell-Platten eine hohe Treue zu einer bestimmten Fokusebene sicherstellen. Wie bei der Einrichtung für die Polarisationsmikroskopie muss das PureFocus850 zwischen dem Objektiv und dem Analysator positioniert werden, aber die anderen erforderlichen Komponenten – insbesondere die Nomarski-Wollaston-Prismen – beeinträchtigen die Leistung nicht. Obwohl das PureFocus850-Laserlicht das Prisma zweimal durchläuft, und zwar auf dem Weg zur und von der Probe, haben die Trennung des Laserlichts und seine Rekombination keinen wesentlichen Einfluss auf die Intensität des Signals auf dem PureFocus850-Sensor.

Sind Sie an PureFocus850 für Ihre Anwendung interessiert?

Wie in diesem Artikel und in früheren Artikeln dargestellt, ist das PureFocus850 mit den meisten Mikroskopietechniken der Biowissenschaften kompatibel. Bitte setzen Sie sich mit uns in Verbindung, um Ihre Anforderungen zu besprechen oder welches Mikroskop Sie aufrüsten möchten.

Ist das PureFocus850 mit industriellen Mikroskopietechniken kompatibel, die mit Auflicht arbeiten?

In diesem Artikel haben wir uns auf die Durchlichtmikroskopie in den Biowissenschaften konzentriert, der PureFocus850 ist ebenso kompatibel mit Auflichtmikroskopietechniken, einschließlich Fluoreszenz, wie zuvor beschrieben. In einem zukünftigen Artikel werden wir untersuchen, wie der PureFocus850 ein leistungsstarkes Werkzeug für die industrielle Mikroskopie bei der Verwendung von Auflicht-Hellfeld, Dunkelfeld, DIC und anderen Techniken ist.

Lesen Sie hier, wie das PureFocus850 den Durchsatz beim Wafer-Scanning erheblich verbessert hat.