PureFocus850助力透射偏光显微镜、相差显微镜和 微分干涉相差显微镜
24.01.24
硬件自动对焦如何应用于专业的生命科学显微镜技术？
在上一篇文章中，我们谈到了最常规的生命科学显微镜技术，并探讨了我们的硬件自动对焦设备PureFocus850如何与这些技术联用和它能带来的优势。现在，我们将探索其他几种常见但更为专业的技术，它们的光路中包含更多的光学元件。尽管对于硬件自动对焦等光学设备来说，这似乎是一种挑战，但我们讲解了PureFocus850是如何在设计时就考虑到了这些技术，以及如何避免可能与这些光学元件产生的冲突。
偏光显微镜
偏光显微镜是更为专业的技术之一，可用于观察特殊的生命科学样品。它依靠起偏器将白光线性偏振至特定方向后穿透样品，再依靠检偏器（另一个线性偏振器）来筛选偏振角被样品改变了的光线。任何未被样品改变的光或者来自显微镜周围环境的光都会被检偏器阻挡。起偏器和检偏器通常处于正交检偏位，旨在最大限度地消除任何未被改变的光。光的偏振方式有很多（例如圆偏振），但出于本文的目的，我们将仅对线偏振进行讲解。
什么是线偏振？
光可以被看作是一种波。偏振是指振动的方向垂直于波的传播方向。白光是非偏振的——光波在任何可能的方向上振动。起偏器只允许以特定方向振动的光通过。因此，在偏光显微镜下，样品仅会被具有特定偏振的光照射。
偏光显微镜下，样品将显示其双折射性——线偏振光在穿透样品时将发生“双重折射”，产生两束彼此呈90°偏振的光线。在穿过检偏器时，这些光线组分会相互干涉，进而增强样品特定区域的对比度，并使其因特性的不同而呈现不同的颜色。天狼星红是一种病理学染色剂，可用于检测纤维变性，并且会使胶原蛋白在偏振光下呈现红色。对于未染色样品的成像，偏振也大有用处，例如辨别痛风晶体或者分析岩石样品。
偏光显微镜可以使用硬件自动对焦吗？
当然可以——只需调整自动对焦系统的安装，避开显微镜检偏器的影响即可。检偏器之所以成为障碍，是因为硬件自动对焦系统用于获取焦点的激光源所发出的也是偏振光。很多自动对焦系统是安装在显微镜相机端口上的，而显微镜的检偏器会阻挡自动对焦激光源。
但是，PureFocus850是安装在显微镜的无限远空间内的，因此可以兼容偏光显微镜。应该将其安装在偏光显微镜的物镜和检偏器之间以避开干扰。大多数商用显微镜都可以将检偏器安装在PureFocus850和显微镜相机或目镜之间。
相差、浮雕相衬和梯度相衬
生命科学样品通常是透明的。在过去，研究者们通过染色来提高不同样品特征与背景之间的对比度。然而，着色过程不仅非常耗时，还会降低样品质量并且无法进行活体样品成像。随着时间的推移，产生对比度的技术也在不断发展迭代，出现了相差、浮雕相衬（霍夫曼调制）和梯度相衬等技术。
虽然这些技术使用了不同的组件，但它们都基于相同的原理，即将穿过样品后光的相位差转换为光强度差，从而提高显微镜观察的对比度。相差技术依靠的是光线穿过样品时所产生的相移，以及成像时相移光和非相移光之间的干涉。浮雕相衬和梯度相衬则依赖于由样品内局部区域的厚度差异所产生的相位梯度，使光偏转到光学元件上具有不同透射特性的不同区域。这两种技术都能在图像中凸显出存在相位差的区域，与“背景”形成鲜明对比，也就是样品中未产生相位差的部分。
什么是相位差？
简单地说，当光从一种介质（或折射率）传播到另一种介质时，就会产生相位差。将光视为一种波，那么光所通过的介质的变化会改变光波周期中的点。诸如细胞膜和其他细胞器等各种细胞特征结构就可以被划分为不同的介质。利用光线穿过这些特征时产生的相位改变，各种技术中所使用的光学元件就能够产生可在显微镜下观察到的对比度（信号幅度的差异）。
这些技术中所有的特殊组件都不会影响PureFocus850的功能，因为PureFocus850的激光不会与这些组件相互作用。尽管更高的对比度会使基于相机的自动对焦更容易实现，但对于高通量应用而言，硬件自动对焦的速度依然更具优势。由于相差技术通常会涉及到活细胞成像，而且现在，往往会配合人工智能，用于在未做荧光标记或染色的情况下表征细胞器和其他细胞内特征，因此PureFocus850还可以支持延时实验或高内涵筛选应用，而在这些应用中，丢失焦点可能会造成数小时的时间浪费。
微分干涉相差
微分干涉相差（DIC）利用了多种相差显微镜技术和偏光显微镜技术，用于在透明或弱对比样品的成像中产生对比度。该技术的光路较为复杂：
- 将显微镜光源发出的光线偏振至45°
- 偏振光进入Nomarski-Wollaston棱镜，并被分成两束彼此呈90°偏振的光线。
- 两束光线被剪切并穿过样品——它们穿过样品中临近的两点。
- 当两点处样品的折射率或厚度不同时就会使两束光线产生相位差。而相位差的大小则取决于折射率或厚度差异的大小。
- 穿过样品后，光线经过第二个Nomarski-Wollaston棱镜并被重新合并成一束光线——由第一个棱镜引起的剪切被第二个棱镜消除。重新合并而成的光线偏振方向仍然不同，所以不会发生干涉。
- 重新合并而成的光线穿过检偏器，将其中两束光线的偏振转入同一平面，并产生干涉。在样品引发了相位差的区域，光线将发生相长干涉或相消干涉。而在没有引发相位差的情况下，则不会发生干扰。这种干扰差异会在图像中产生类似3D的效果，凸显出不同的特征。
这种干涉所产生的效果与相差显微镜技术类似，但是避免了通常与相差有关的明亮光晕伪影。与其他技术相比，该技术的轴向（Z轴）分辨率也更高。
PureFocus850可以在扫描大面积区域或多孔板时确保对特定焦平面的高度专注，因此显微镜专家们能够充分地利用DIC的高轴向分辨率。与偏振光显微镜的安装方式相同，PureFocus850必须放置在物镜和检偏器之间，而所需的其他组件（尤其是Nomarski-Wollaston棱镜）则不会影响其性能。尽管PureFocus850激光会两次穿过棱镜（前往样品和从样品返回），但激光的分割和重新合并不会显著影响PureFocus850传感器上的信号强度。
想了解Focus850如何帮助您的应用？
如本文和前文所述，PureFocus850能够兼容大多数的生命科学显微镜技术。请与我们联系，探讨您的需求或者您想要升级的显微镜。
PureFocus850可以兼容使用反射光的工业显微镜技术吗？
在本文中，我们重点关注了透射光生命科学显微镜，但Purefocus850也完全兼容反射光显微镜技术，包括前文中讨论过的荧光技术。在未来的文章中，我们将探讨在使用反射明场、暗场、DIC以及其他技术的工业显微镜中，PureFocus850为何是一款强大的工具。您将在文中了解到PureFocus850如何极大地提高了晶圆扫描的通量。
