Biowissenschaftliche Mikroskopie mit dem PureFocus850

10.01.24

In diesem Artikel besprechen wir die Kompatibilität des PureFocus850 mit der Durchlicht-Hellfeld-, Durchlicht-Dunkelfeld- und Fluoreszenzmikroskopie sowie die Vorteile der Installation eines Hardware-Autofokus in einem Mikroskop. Andere wichtige Mikroskopietechniken für die Biowissenschaften werden im nächsten Artikel besprochen, halten Sie also die Augen offen oder kontaktieren Sie uns, wenn Sie mehr über eine andere Technik wissen möchten.

Was sind die Vorteile eines Hardware-Autofokus in der Mikroskopie?

Hardware-Autofokussysteme sind in der Life-Science-Mikroskopie äußerst nützlich. Sie können eingesetzt werden, um den Durchsatz bei der Bildgebung zu erhöhen oder um sicherzustellen, dass die Proben für die Dauer eines langen Zeitrafferexperiments im Fokus bleiben.

Sie nutzen die Reflexion eines Lasersignals von der Probe, um deren Position im Raum zu bestimmen, und passen dann automatisch die Fokussierungsachse (Z-Achse) des Mikroskops an, um die Probe wieder in den Fokus zu bringen.

Dadurch haben sie drei wesentliche Vorteile gegenüber kamerabasierten Autofokuslösungen:

1. Sie sind nicht auf den Kontrast der Probe angewiesen, was bedeutet, dass fluoreszierende oder ungefärbte Proben einfacher im Fokus gehalten werden können.
2. Die Fokussierung erfolgt extrem schnell und in Echtzeit, während kamerabasierte Lösungen mehrere Sekunden des Scannens über die Z-Achse des Mikroskops erfordern.
3. Hardware-Autofokuslösungen verfolgen die Probenoberfläche, so dass es nicht erforderlich ist, die Fokus-Position an verschiedenen Punkten der Probe vorzudefinieren.

Der PureFocus850 von Prior ist ein äußerst vielseitiger Hardware-Autofokus mit zahlreichen Funktionen, die es Mikroskopikern im Bereich der Biowissenschaften ermöglichen, diese Vorteile in einem breiten Spektrum von Mikroskopietechniken und Probentypen zu nutzen. Für die Life-Science-Mikroskopie ist es von entscheidender Bedeutung, dass das PureFocus850 die Oberfläche von Deckgläsern verfolgen kann, während es den Fokus auf der darunter liegenden Probe beibehält.

Wie passt sich der Hardware-Autofokus an verschiedene Mikroskopietechniken an?

Hellfeld-Mikroskopie

Die Durchlicht-Hellfeldmikroskopie (diaskopisch) von Dünnschliffen ist wohl die routinemäßigste Mikroskopietechnik. Einfach ausgedrückt: Weißes Licht durchdringt die Probe, und die Unterschiede in der Lichtabsorption und -streuung an den verschiedenen Merkmalen ergeben ein Bild. „Hellfeld” bezieht sich auf den nahezu weißen Hintergrund, der sich von den dunkleren Merkmalen der Probe abhebt.

Das PureFocus850 verfügt über eine Offset-Mechanik, die es ermöglicht, den Fokus auf der Probe zu halten, indem die kontrollierte Oberfläche eines Deckglases verfolgt wird – ein wesentliches Merkmal für die Abbildung selbst der meisten Standard-Objektträger. Biowissenschaftliche Proben sind schwach reflektierend, und daher wird das Deckglas vom PureFocus850 erkannt. Die Offset-Mechanik ermöglicht es dem Purefocus850, auf das Deckglas zu fokussieren, während die Mikroskopokulare oder die Kamera auf die Probe fokussiert sind.

Für einige Anwendungen, wie z. B. die Analyse von Blutzellen, sind jedoch Ölimmersionsobjektive mit hoher Vergrößerung erforderlich, um Probenmerkmale ausreichend detailliert aufzulösen. Dies verhindert, dass die Außenfläche des Deckglases vom PureFocus850 genutzt werden kann, da Immersionsöl und Glas sehr ähnliche Brechungsindizes haben. Der Offset kann jedoch so eingestellt werden, dass stattdessen die innere Oberfläche des Deckglases erfasst werden kann.

Bei der Hellfeldmikroskopie wird in der Regel eine Farbkamera mit hoher Erkennungseffizienz im sichtbaren Lichtspektrum eingesetzt: Der PureFocus850-Laser verwendet eine Infrarot-Wellenlänge, um zu vermeiden, dass das Lasersignal auf dem Bild der Probe erscheint.

Dunkelfeld-Mikroskopie

Die Transmissions-Dunkelfeldmikroskopie findet in den Biowissenschaften zahlreiche Anwendungen. Am häufigsten wird sie zur Beobachtung von Gewebeschnitten oder Zellen verwendet, die einen geringen Eigenkontrast aufweisen, so dass die Hellfeldmikroskopie als Beobachtungsmethode ungeeignet ist.

Die Dunkelfeldmikroskopie beruht auf der Reflexion oder Brechung des Lichts, das die Probe durchdringt und so vom Objektiv erfasst werden kann. Das Licht, das nicht von der Probe beeinflusst wird, wird nicht aufgefangen. Dies führt dazu, dass der Hintergrund dunkel ist (daher der Name Dunkelfeld!) und die Proben hell erscheinen. Dies wiederum ermöglicht es, intrazelluläre Details zu beobachten, ohne die Probe anzufärben, oder kleine Partikel oder Verunreinigungen in der Probe leichter zu erkennen.

Da das PureFocus850 nicht auf den Kontrast angewiesen ist, um die Schärfe des Systems zu halten, beeinträchtigt das bei der Dunkelfeldmikroskopie häufig auftretende schwache Signal die Leistung nicht. Bei der Dunkelfeldmikroskopie besteht außerdem die Gefahr, dass Objekte außerhalb der Probenebene im Bild hell erscheinen, und kamerabasierte Autofokusverfahren können diese Objekte fälschlicherweise fokussieren. Da sich das PureFocus850 nur auf das Deckglas zur Fokussierung verlässt, werden diese Fehler vollständig vermieden.

Fluoreszenzmikroskopie

Die Dunkelfeldmikroskopie kann zwar Kontrast in transparenten Proben liefern, hebt aber keine spezifischen Merkmale hervor und ist in der Größe der hervorgehobenen Merkmale begrenzt. Die Fluoreszenzmikroskopie, entweder durch Transformation lebender Zellen oder Organismen oder durch Markierung von Schnitten, ermöglicht dagegen die Lokalisierung und Identifizierung spezifischer Organellen und anderer subzellulärer Merkmale.

Bei der Fluoreszenz handelt es sich um ein Phänomen, bei dem ein Objekt, in der Mikroskopie typischerweise ein an ein Protein konjugierter molekularer Marker, Licht bei einer Wellenlänge absorbiert und bei einer längeren Wellenlänge emittiert. Durch diese Unterscheidung zwischen absorbiertem und emittiertem Signal kann das ausschließlich von der fluoreszierenden molekularen Markierung emittierte Licht nachgewiesen werden, wenn das Mikroskop mit einer Optik ausgestattet ist, die nur Licht dieser Wellenlänge zum Detektor durchlässt. Das Gesamtergebnis ist, dass diese spezifischen Merkmale nun vor einem schwarzen Hintergrund stark hervorgehoben werden.

In ein und derselben Probe können mehrere Merkmale mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen abgebildet werden. Mit motorisierten Vorrichtungen wie Filterrädern und Revolvern können die richtigen Anregungsfilter (zur Auswahl der Absorptionswellenlänge) und Emissionsfilter (zur Auswahl der Emissionswellenlänge) in den Lichtweg des Mikroskops gebracht und Bilder nacheinander aufgenommen werden. Anschließend kann ein zusammengesetztes Bild der verschiedenen markierten Positionen erstellt werden.

Die Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie sind vielfältig und reichen von relativ einfachen Weitwinkeltechniken wie der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder dem High-Throughput-Screening bis hin zu komplexeren High-End-Mikroskopieverfahren wie der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopie und der Total-Internal-Reflection-Mikroskopie (TIRF).

Fluoreszenzmarker benötigen in der Regel Anregungslicht im nahen ultravioletten und im fernen roten Wellenlängenbereich. Daher darf ein Hardware-Autofokus nicht mit den Wellenlängen interferieren, die für die Bilderzeugung verwendet werden. Das PureFocus850 verwendet einen 850nm-Laser, der jenseits der Emissionswellenlänge von Cy7 liegt, einer gängigen Fluoreszenzmarkierung, die im nahen Infrarotspektrum emittiert. Darüber hinaus überträgt das PureFocus850 Nah-UV und sichtbares Licht, so dass es zwischen den optischen Fluoreszenzkomponenten und dem Objektiv positioniert werden kann. Dies ist wichtig, da es bei der Konfiguration eines Fluoreszenzmikroskops völlige Flexibilität bei der Wahl der optischen Komponenten ermöglicht.

Wie kann das Purefocus850 an andere High-End-Mikroskopietechniken angepasst werden?

Obwohl wir viele der beliebtesten Mikroskopietechniken der Biowissenschaften besprochen haben, ist die Liste nicht vollständig. Das PureFocus850 kann für die Verwendung mit verschiedenen anderen High-End-Mikroskopietechniken modifiziert werden – wie z. B. Multiphotonenmikroskopie – die mittleres UV- oder Infrarotlicht verwenden und möglicherweise spezielle optische Materialien oder Beschichtungen erfordern.

Sind Sie an PureFocus850 für Ihre Anwendung interessiert?

Wenn Sie eine spezielle Anwendung haben, die hier nicht erwähnt wurde, kontaktieren Sie uns bitte, um Ihre Anforderungen zu besprechen. In unserem nächsten Blog-Beitrag werden wir die Kompatibilität des PureFocus850 mit Phasenkontrastverfahren, differentiellem Interferenzkontrast und Polarisationsmikroskopie diskutieren.